بررسی اثر عصاره دارچین بر میزان بیان و جابجایی ملکول ناقل گلوکز ایزوتیپ -4 (glut4) در رده سلولی c2c12

بیماری دیابت به عنوان شایعترین بیماری متابولیک شناخته میشود که از مهمترین علل آن مقاومت به انسولین می باشد. عدم کنترل دیابت می تواند عوارض خطرناکی مثل نابینایی، نارسایی کلیوی، بیماریهای قلبی - عروقی، اسیدوز متابولیک و مرگ را بدنبال داشته باشد. انسولین با اثر بر فرایندهای مختلف متابولیسم سلولها مصرف گلوکز را افزایش داده و منجر به کاهش غلظت قند خون در انسان می گردد. مهمترین فرایندی که انسولین با اثر بر آن قند خون را کاهش می دهد، افزایش بیان و جابجایی ناقل شماره 4 انتشار تسهیل شده گلوکز یعنی glut4 می باشد. تا به امروز تعداد 13 ناقل گلوکز شناسایی شده اند که کار انتقال قندهای مثل گلوکز، گالاکتوز، مانوز، گلوکزامین، گزیلوز و فروکتوز را بعهده دارند. همه این ناقلین ساختار گلیکوپپتیدی مشابه داشته و بصورت ملکولی 12 بار گذرنده از غشاء می باشند. امروزه بیشتر مطالعات بر glut4 متمرکز می باشند. زیرا این مولکول در بافتهای چربی و عضله، که عمده ترین مصرف کنندگان گلوکز می باشند. به فراوانی وجود دارد. و تحت اثر انسولین بیان ژن و جابجایی گلیکوپروتئین آن از درون سلول به سمت غشاء سیتوپلاسمی تحریک می شود. از بین استراتژیهای درمانی دیابت نوع 2 می توان به درمانهای گیاهی اشاره نمود. در واقع این نوع درمانها به دلیل کمتر بودن عوارض جانبی و پذیرش چنین درمانهایی توسط بیماران نسبت به درمانهای شیمیایی امروزه بیشتر مورد توجه قرار گرفته اند. گیاهای مثل هندوانه ابوجهل، شنبلیله جیزنگ، چای سبز، زردچوبه و دارچین باعث کاهش قند خون در انسان و حیوانات آزمایشگاهی می شوند. لیکن به دلیل روشن نبودن مکانیسم عملکرد ترکیبات موجد در این گیاهان هنوز هم مصرف آنها بعنوان گزینه درمانی دیابت نوع 2 مورد تردید می باشد. دارچین از قدیم الایام در ایران بعنوان ادویه دارویی مورد استفاده بوده است. مطالعات کارآزمایی بالینی و حیوانی انجام شده روی خواص درمانی دارچین بویژه در خصوص درمان دیابت حاکی از تأثیر این گیاه در کاهش قند خون بوده است در واقع اثر ضد دیابتی این گیاه به ترکیبات فنلیک موجود در آن نسبت داده می شود مانند هیدروکسی کالکون، هیدروسینامیک اسید و کاتچینها لذا طبق شواهد موجود به نظر می رسد مصرف دارچین باعث کاهش قند خون می شود. اما مکانیسم ترکیبات موجود در دارچین هنوز هم نامشخص است مدلهای کشت سلولی وسیله ای مناسب برای بررسی مکانیسمهای احتمالی عملکرد ترکیبات گیاهی هستند زیرا در این مدلها اثری از عوامل مداخله گری که در بدن موجود زنده می توانند نتایج بررسی مکانیسم عملکرد یک عامل اثر گذار را مخدوش کنند وجود ندارند و در این نوع مدلها اثر خالص عوامل اثر گذار بررسی می شوند. این مدلهای کشت سلولی باید بگونه ای طراحی شوند که شاخص بافتهای اصلی مصرف کننده گلوکز محسوب گردند یعنی بافت عضلانی وچربی، سلولهای 3t3-l1 بعنوان الگوی بسیار خوبی برای بافت چربی مطرح بوده و مطالعات بسیاری در خصوص تنظیم بیان و جابجایی glut4 یعنی ناقل گلوکزی که تنظیم کننده متابولیسم گلوکز با واسطه انسولین می باشد، انجام گردیده اند.اما بافت چربی از نظر متابولیسمی بافت. کاملا فعالی نیست. در عوض بافت عضلانی بیشترین میزان مصرف گلوکز به تحریک انسولین در بدن را بعهده دارد که این مصرف بالای گلوکز باواسطه glut4 انجام می شود. لذا وجود رده سلولی که بتواند شاخص بافت عضلانی باشد، قادر به بیان glut4 بوده و شرایط کشت و تمایز آن نیز آسان باشد بعنوان مدل مناسبی برای بررسی اثر عصاره گیاهان دارویی بر متابولیسم گلوکز ضرورتی انکار ناپذیر است. سه رده سلولی عضله اسکلتی مورد استفاده محققین برای مطالعه عملکرد انسولین و متابولیسم گلوکز تا به امروز عبارت بوده اند از: c2c12،l6 و bc3h1 اما به هر حال رده سلولی c2c12 به دلیل قابلیت پاسخ به تغییرات عوامل تنظیم کننده بیان glut4 رده بهتری محسوب می شود به دلیل محدود بودن مطالعات انجام شده روی اثر ترکیبات گیاهی بر بیان و جابجایی glut4 در اجزاء سلول هنوز مشخص نیست که آیا رده سلولی c2c12 رده سلولی کار آمدی برای این قبیل مطالعات می باشد و می تواند بعنوان شاخصی از بافت عضله مخطط محسوب گردد؟ اهداف ما در این پژوهش عبارت بودند از: تعیین اثر عصاره دارچین بر میزان glut4 موجود در غشاء سیتوپلاسمی و جزء غشاء هسته و شبکه آندوپلاسمی میوتیوبهای c2c12 و بررسی کارآیی این رده سلولی برای مطالعات تعیین اثر عصاره گیاهان دارویی بر متابولیسم گلوکز با واسطه glut4 .طراحی مطالعه: این مطالعه بصورت تجربی و روش انجام آن کار آزمایی آ‍زمایشگاهی بود که در دو فاز انجام شد؛ فاز اول شامل set up کردن روشها، بدست آوردن سلولهای تمایز یافته بافت عضلاتی حاصل از کشت سلولهای c2c12 و بررسی کارآیی این سلولها برای بیان glut4 بطوریکه با روشهای مورد استفاده ما قابل تشخیص و سنجش باشد و فاز دوم شامل بررسی اثر دو غلظت مختلف عصاره دارچین بر میان glut4 موجود در اجزاء سلولهای تمایز یافته و مقایسه آنها در قالب مطالعه ای مداخله ای . مواد و روشها: عصاره مورد استفاده در این پژوهش عصاره محلول در آب دارچین بود که با استفاده از محلول استیک اسید 1/. نرمال و الکل اتانل تهیه شد، سپس در انکوباتور 60 درجه سانتی گراد خشک گردید. پودر حاصل از این مرحله در حلال دی متیل سولفوکساید حل شد و یا غلظت 100 میلی گرم در میلی لیتر بعنوان محلول ذخیره مورد استفاده قرار گرفت. کشت اولیه میوبلاستهای c2c12 در محیط 20+ dmem درصد سرم جنین گاو تا رسیدن به حدود 80 درصد میزان اتصال انجام شد. سپس تمایز میوبلاستها به میوتیوبهای عضلانی با تعویض محیط کشت اولیه به محیط کشت تمایز که دارای ترکیب dmem + درصد سرم اسب بود صورت گرفت. برای فاز اول مطالعه در روز دوم شروع مرحله تمایز به یک گروه از سلولها غلظت 1 میکرومولار دگزامتازون افزوده شد. از روز 5 بعد از تمایز کامل میوبلاستها به میوتیوبهای عضلانی به یک گروه دیگر غلظت 1 درصد dmso و به گروهی دیگر غلظت 10 میکروگرم دارچین به مدت 3 ساعت افزوده شد. برای فاز دوم مطالعه نیز به یک گروه از میوتیوبهای عضلانی در روز ششم تمایز غلظت 1 درصد dmso در محیط تمایز و به یک گروه دیگر غلظتهای 100 یا 1000 میکروگرم دارچین افزوده شد. برای فاز اول مطالعه تنها غشاء سیتوپلاسمی میوتیوبها جداسازی گردید ولی برای فاز دوم علاوه بر غشاء سیتوپلاسمی، شبکه آندوپلاسمی و غشاء هسته میوتیوبها نیز جداسازی شدند و میزان گلیکوپروتئین glut4 در هر دو جزء به این شکل سنجیده شد که ابتدا هموژن سلولها تهیه و دو جزء سلولها با استفاده از اولتراسانتریفوژ جداسازی شد. یک جزء شامل غشاء هسته سلول و شبکه آندوپلاسمی و جزء دیگر شامل غشاء سیتوپلاسمی سلول بود سپس پروتئینهای این فراکشنها با استفاده از روش الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید جداسازی و گلیکوپروتئین glut4 با استفاده از روش وسترن بلات و آنتی بادی اختصاصی ضد glut4 شناسایی و بصورت نسبی تعیین مقدار گردید. روش شناسایی و تعیین مقدار glut4 در فاز اول استفاده از دستگاه لومینومتر و در فاز دوم مطالعه استفاده از فیلم حساس به نور بود. در نهایت داده های حاصل از آزمایشات در نرم افزار spss ویر است14 با استفاده از روش آزمون t- دو نمونه مستقل مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفتند. و نمودارهای مقایسه باندهای حاصل از آزمون و سترن بلات در نرم افزار excel ترسیم شدند. یافته ها: مقایسه درصد میزان glut4 موجود درجزء غشاء هسته و شبکه آندوپلاسمی میوتیوبهای c2c12 نشان می داد که میوتیوبهای تحت تأثیر هر دو غلظت 100و 1000 میکرو گرم دارچین به مدت 3 ساعت در مقایسه با گروه شاهد دارای مقادیر کمتری glut4 می باشند. در حالیکه برای جزء حاوی غشاء سیتوپلاسمی میزان glut4 در گروه تحت تأثیر غلظتهای 100 و 1000 میکروگرم دارچین بیش از گروه شاهد بود. از طرفی مقایسه میزان glut4 موجود در جزء غشاء هسته و شبکه آندوپلاسمی گروه های تحت تأثیر غلظتهای 100 و 1000 میکروگرم دارچین به مدت 3 ساعت نشان می داد که گروه تحت تأثیر 100 میکروگرم عصاره دارچین دارای مقدار بیشتری glut4 نسبت به گروه تحت تأثیر 1000 میکروگرم بود برای جزء حاوی غشاءسیتوپلاسمی میوتیوبها این نتیجه معکوس بود و سلولهای تحت تأثیر غلظت 1000 میکروگرم دارچین میزان glut4 بیشتری در جزء غشاء سیتوپلاسمی نسبت به گروه تحت تأثیر غلظت 100 میکروگرم عصاره دارچین یا گروه شاهد بودند. گروه تحت تأثیر غلظت 100 میکروگرم عصاره دارچین نیز میزان glut4 بیشتری در جزء غشاء سیتوپلاسمی خود نسبت به گروه شاهد داشتند. در کلیه موارد با ضریب اطمینان 95./. مقایسه دو به دوی گروهها نشان می داد که درصد میزان glut4 بین گروهها با یکدیگر بطور معنی دار تفاوت دارند(در همه موارد 5./.>p).مسیر انتقال پیام انسولین در سلولهایی که تنظیم مصرف گلوکز آنها تحت تأثیر انسولین انجام می شود، منجمله سلولهای عضلانی، بعد از گیرنده انسولین و اتوفسفوریلاسیون آن به دو مسیر کاملا مجزا تقسیم بندی می شود که یک مسیر منجر به افزایش بیان ژن glut4 و مسیر دیگر جابجایی این گلیکوپروتین از اجزای درون سلولی به سطح غشاء سیتوپلاسمی است. در این پژوهش نشان داده شد. که عصاره محلول در آب دارچین توانسته میزان glut4 موجود در اجزاء درون میوتیوبهای c2c12 را کاهش ولی در غشاء سیتوپلاسمی افزایش دهد همچنین مشخص گردید که رده سلولی c2c12 را کاهش ولی در غشاء سیتوپلاسمی افزایش دهد. همچنین مشخص گردید که رده سلولی c2c12 می تواند رده سلولی مناسبی برای بررسی اثر عصاره گیاهان دارویی بر متابولیسم وابسته به انسولین گلوکز باشد. مطالعات پیشین اثر ترکیبات عصاره دارچین بر افزایش میزان glut4 موجود در بافتهای حیوانات آزمایشگاهی و رده سلولی 3t3-l1 که شاخص بافت چربی است را نشان داده اند. آز آنجا که افزایش بیان ژن و جابجایی پروتئین glut4 از اجزاء درون سلولی به سطح غشاء سیتوپلاسمی مکانیسم اصلی عملکردعوامل کاهش دهنده قند خون محسوب می شود لذا نتایج حاصل از پژوهش ما حاکی از آن است که عصاره دارچین می تواند بعنوان کاندید مناسبی برای درمان یا پیشگیری از دیابت نوع 2 پیشنهاد شود. با این وجود هنوز هم نیاز به مطالعات بیشتری در خصوص جدا سازی ترکیبات موجود در این عصاره و بررسی اثر عصاره یاترکیبات مشخص این گیاه بر سایر مسیرهای متابولیسمی و تنظیمی گلوکز می باشد.